Zum Nachweis von Strukturen, die den HPII als Strukturmotiv enthalten, wurde die von Schröder (1998) etablierte Methode des ,,oligonucleotide-mapping`` verwendet. Es handelt sich bei der Struktursonde 27AB um ein RNA-Oligonukleotid, das strukturspezifisch über den Helixstamm in den Loop des HPII hybridisieren soll (vgl. Abb. 4.8). Dabei wurde kein zusätzliches Nukleotid zwischen den angrenzenden, zum HPII-Loop komplementären Sequenzbereichen inseriert, da François et al. (1994) zeigen konnten, daß ein solches zusätzliches Nukleotid in einer DNA-Struktursonde zur Stabilisierung des Komplexes führt. Durch chemische Modifikationsanalysen von HPII-27AB-Komplexen wurde der Beweis erbracht, daß die Hybridisierung Helixstamm-überlappend erfolgte, was nicht selbstverständlich war, da keine Parameter für solche Tertiärstrukturen für die theoretische Strukturvorhersage zur Verfügung stehen. Hybridisierungstests mit -- und +-strängigen Stäbchenkonformationen ergaben keine Bindung von 27AB, auch wenn die Struktursonde im zehnfachen molaren Überschuß eingesetzt wurde.
Bei den hier durchgeführten Hybridisierungsexperimenten wurden jedoch Ergebnisse erhalten, die auf den ersten Blick keine eindeutigen Schlußfolgerungen zuließen, da z.B. im Fall der pSG111-Transkripte in Anwesenheit der Struktursonde 27AB zusätzliche Banden nachgewiesen werden konnten. Der HPII-Nachweis wurde, abgesehen von der Dialyse, die anstatt bei 4 oC hier bei RT erfolgte, nach dem von Schröder (1998) vorgeschlagenen Protokoll durchgeführt (vgl. Abschnitte 3.6 und 4.3.1). Dieser Unterschied in den Bedingungen hat allerdings nachweislich keinen Einfluß auf die Strukturverteilung. Sowohl nach der Dialyse bei 4 oC als auch bei RT wurde bei der Hybridisierung gegen die pSG111-Transkripte exakt die gleiche Bandenverteilung, wie in Abbildung 4.9 gezeigt, erhalten.
Ein nicht unbedeutender Parameter ergibt sich aus der eingesetzten Transkriptkonzentration. Während bei dem von Schröder (1998) durchgeführten Oligonukleotid-Hybridisierungen jeweils eine definierte Transkriptkonzentration von 400ng eingesetzt wurde, konnte hier im noch zur Verfügung stehenden zeitlichen Rahmen die Hybridisierung nur ohne die Bestimmung der durch in vitro-Transkription erhaltenen molaren Mengen an Transkript erfolgen. Zudem bestand der Anspruch, den HPII-Nachweis direkt im Anschluß an die Synthese ohne weitere Aufreinigung durchzuführen, um mögliche Strukturverteilungsänderungen auszuschließen und um die beim Transkriptionsstopp vorliegende Strukturverteilung zu erhalten. Dadurch ist die Berechnung eines Konzentrationsverhältnisses von Transkript zu Oligonukleotid nicht möglich und eine eventuelle Beeinflussung des vorliegenden Strukturgleichgewichts durch das Oligonukleotid nicht abschätzbar. Die Transkriptkonzentration ließe sich in weiterführenden Experimenten allerdings leicht durch eine Abschätzung über Verdünnungsreihen nach den entsprechenden Transkriptionszeiträumen bestimmen, um sicherzustellen, daß der Einsatz des Oligonukleotids im Unterschuß erfolgt.
Unter der Prämisse, daß die oben erwähnten Faktoren überprüft und unter Umständen optimiert würden, und dennoch die Detektion von zusätzlichen, in der ,,normalen`` Strukturverteilung nicht vorhandenen Banden erfolgt, so stellt sich die Frage, wie eine mögliche unspezifische Bindung von einer spezifischen Bindung des Oligonukleotids diskriminiert werden könnte. Beispielsweise konnten nach der Inkubation der pSG111-Transkripte mit der Struktursonde 27AB die beiden zusätzlichen Banden ,,X`` und ,,Y``, welche in der Strukturverteilung in Abwesenheit des Oligonukleotids fehlen, nachgewiesen werden (vgl. Abb. 4.9 und 4.10). Die daraufhin gerechnete ,,pseudo bimolekulare`` Strukturvorhersage (vgl. Abschnitt 4.4.1) lieferte eine mögliche Bindung der Struktursonde schon bei niedrigen Temperaturen an die Stäbchenstruktur (vgl. Abb. 4.14). Das Mobilitätsverhalten der Bande ,,X`` könnte auf ein von dem Oligonukleotid gebundenes Stäbchen hinweisen. Zudem könnte es sich bei ,,Y`` um eine temperaturabhängige, durch die Struktursonde bewirkte Umfaltung von komplexierten HPII-Strukturen handeln. Durch Präinkubation der PSTVd-Transkripte läßt sich die thermodynamisch stabilste Stäbchenstruktur selektiv einstellen (siehe Baumstark & Riesner, 1995). Dabei werden unter Hochsalzbedingungen (500mM NaCl) sämtliche Sekundärstrukturen durch Denaturierung für z.B. 5min bei 90 oC aufgelöst und der Ansatz langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Die so struktureingestellten Stäbchenkonformationen können dann zur Hybridisierung eingesetzt werden. Da durch die Präinkubation sämtliche metastabilen Strukturen aufgelöst wurden, sind nur noch unspezifische Signale nach der Auftrennung der Strukturen mittels TGGE detektierbar. Würde sich unter diesen Bedingungen im Fall der pSG111-Transkripte wiederum die Bande ,,X`` detektieren lassen, so wäre der Beweis erbracht, das es sich bei diesen Strukturen um komplexierte Stäbchen handelt. Würde zudem gleichzeitig die Bande ,,Y`` auftreten, so wären diese Strukturen nicht durch eine Umfaltung von HPII-27AB-Komplexen entstanden.
Die Kombination aus Oligonukleotid-Hybridisierung und chemischer Modifikation stellt eine weitere Möglichkeit zur strukturellen Charakterisierung von spezifischen und unspezifischen Signalen dar. Dazu würde zuerst die Inkubation der Transkripte mit der Struktursonde erfolgen. Daran anschließen würde sich die nach Schröder (1998) optimierte chemische Modifikation, wodurch Strukturumlagerungen verhindert werden. Die interessanten Strukturen könnten nun mittels TGGE aufgetrennt, geleluiert und durch ,,Primer extension`` auf enthaltene einzel- und doppelsträngige Sequenzbereich hin analysiert werden, sodaß eine Unterscheidung von spezifischer und unspezifischer Oligonukleotid-Hybridisierung zur eindeutigen Identifizierung von HPII-Strukturelementen möglich ist.