Bedingungen für den Nachweis metastabiler RNA-Strukturen

In vivo gebildete, metastabile Strukturen liegen in zu geringer Konzentration in der Zelle vor, um nachgewiesen zu werden. Zudem erschwert die zeitabhängige Stabilität dieser suboptimalen Strukturen die Detektion einer in situ vorliegenden Strukturverteilung. Zum einen darf bei der Präparation der RNA weder eine Umfaltung durch Faktoren wie z.B. die Ionenstärke oder der Einfluß von Detergenzien erfolgen, zum anderen wird die Ausbeute an Molekülen zusätzlich durch in der Wirtszelle enthaltene RNasen verringert. Unter in vitro-Bedingungen lassen sich dagegen etliche dieser Faktoren ausschalten, wobei allerdings eine Adaptation des System an in vivo-Bedingungen erfolgen muß, damit eine Strukturbildung durch sequentielle Faltung im korrekten, den in vivo-Bedingungen angepaßten Zeitrahmen stattfinden kann.

Hinweise auf die zu wählenden Bedingungen für ein in vitro-Transkriptionssystem mit der T7-RNA-Polymerase ergaben sich aus der Arbeit von Repsilber (1995). Dort konnte gezeigt werden, daß die Bildung metastabiler Strukturen extrem von der Transkriptionsdauer und/oder -geschwindigkeit abhängt:

Metastabile Strukturen

können bevorzugt bei geringen Transkriptionsraten und/oder kurzen Inkubationszeiten nachgewiesen werden.

Thermodynamisch stabilisierte Strukturen

dominieren dagegen bei hohen Transkriptionsraten und/oder langen Inkubationszeiten. Dabei ergeben sich suboptimale Strukturen durch sequentielle Faltung in wesentlich geringeren Konzentrationen.

Unter optimalen Bedingungen bei 37  ^oC erfolgt die Transkription durch die T7-RNA-Polymerase mit einer Elongationsrate von ca. 230nt/s (Golomb & Chamberlin, 1974). Im Vergleich dazu weist die PolymeraseII in vivo eine deutlich geringere Rate zwischen 5 und 25nt/s auf (Manley, 1984; Marzluff & Huang, 1984; Kadesch & Chamberlin, 1982). Daraus ergibt sich als erster, absolut entscheidender Parameter für die Kalibrierung des Transkriptionssystems die Elongationsrate der T7-RNA-Polymerase . Faktoren, die eine Variation der Transkriptionsrate ermöglichen sind z.B. die Ionenstärke, die Viskosität des Mediums oder der Einsatz spezifischer Inhibitoren. Allerdings handelt es sich hierbei um Parameter, die gleichzeitig Einfluß auf die Strukturbildung haben. Eine Regulation über die Temperatur wäre denkbar. Dabei ist jedoch zu beachten, daß gleichzeitig die Kinetik der Strukturfaltung sowie der Umlagerung der Strukturen beeinflußt werden könnte. Eine weitere Möglichkeit stellt die Variation der NTP-Konzentration dar, durch die die Transkriptionsrate in einem weiten Bereich einstellbar ist (Chamberlin & Ring, 1973; Masukata & Tomizawa, 1990). Dabei ist darauf zu achten, daß die vier Nukleotidtriphosphate in gleichen molaren Konzentrationen vorliegen, was für das in dieser Arbeit erstmals verwendete Nachweisverfahren über den Einbau von radioaktiv markiertem $\alpha^{32}_{}$P-UTP von Bedeutung ist. Zudem ist die Detektion der metastabilen Strukturen, wie schon erwähnt, bei kurzen Transkriptionszeiten möglich (vgl. dazu Abschnitt ,,Nachweis der Transkripte`` auf S.). Unter Berücksichtigung dieser Aspekte wurden die Bedingungen für das in vitro-Transkriptionssystem zur Anpassung an die natürlichen Bedingungen in der Zelle wie folgt gewählt:

1. Die Transkriptionsansätze wurden alle bei 25  ^oC inkubiert. Damit findet die Strukturfaltung bei einer den in vivo-Bedingungen entsprechenden Temperatur statt. Zudem ist hier gleichzeitig die Transkriptionsrate der T7-RNA-Polymerase im Vergleich zu den optimalen Bedingungen bei 37  ^oC verringert.
2. Die Nukleotidtriphosphate wurden in einer Konzentration von 500 $\mu$ M eingesetzt, was im Vergleich zu den von Rachen (1997) durchgeführten Untersuchungen eine Halbierung der NTP-Konzentration und damit eine weitere Erniedrigung der Elongationsrate bedeutet, um tendenziell den in vivo-Bedingungen für die PolymeraseII noch näher zu kommen.
3. Alle anderen Parameter wurden auch in Hinblick auf die Vergleichbarkeit mit den von Repsilber (1995) und Rachen (1997) durchgeführten Untersuchungen konstant gehalten (vgl. Abschnitt 3.3.4).

Repsilber (1995) konnte für die Transkription des Plasmids pSH1 (Heinrich, 1994) bei 25  ^oC und einer NTP-Konzentration von je 400 $\mu$ M eine Transkriptionsrate von $\sim$ 84nt/s bestimmen. Eine Abschätzung der Transkriptionsraten konnte im zeitlichen Rahmen dieser Arbeit nicht mehr erfolgen. Da sich die hier verwendeten cDNA-Matrizen nur in den Startstellen für die Transkription und nicht in der Basenzusammensetzung - abgesehen von zusätzlichen 11 Nukleotiden am 3'-Ende von pSH1 - unterscheiden, kann in den hier durchgeführten Experimenten von einer Transkriptionsrate in dieser Größenordnung ausgegangen werden. Die verwendeten Bedingungen stellen einen gewissen Kompromiß zwischen der Verringerung der Transkriptionsrate und der Nachweisbarkeit der Transkripte dar, da anfängliche Versuche mit einer NTP-Konzentration von 50 $\mu$ M aufgrund der zu geringen Nachweisempfindlichkeit der Autoradiographie zu keinem Ergebnis führten. Eine Erhöhung der Sensitivität zum Nachweis der Transkripte steht mit dem Bio-Imaging-System (vgl. Abschnitt 3.5.5) zur Verfügung. Mit dieser Methode konnte die Hybridisierung des Strukturoligonukleotids 27AB (siehe Abb. 4.10 und 4.12) verfolgt werden, obwohl die getrockneten Gele nur eine Aktivität von 40cpm (mit dem Handzähler gemessen) aufwiesen.

Durch die verringerte Elongationsrate ergeben sich für die Synthese von Vollängentranskripten mit 359nt Länge Zeiten von wenigen Sekunden. Damit ist jedes Polymerase-Moleküle in der Lage, auch bei der kürzesten Inkubationszeit von 30s mehrere Transkripte zu synthetisieren. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, daß auch nach 30s überwiegend Vollängentranskripte entstehen, allerdings nur in einer sehr geringen Konzentration (Repsilber, 1995).

Desweiteren muß die zeitabhängige Stabilität der metastabilen Strukturen mit in die Betrachtung der für den Nachweis zu verwendenden Bedingungen einbezogen werden. Beeinflußt wird die Metastabilität durch die Temperatur. Ziel der Detektion ist es, die nach einer bestimmten Inkubationszeit durch Abstoppen der Transkriptionsreaktion mit EDTA erhaltene Strukturverteilung zu ,,fixieren`` und durch die Auftrennung mittels TGGE zu analysieren. Aus diesem Grund erfolgt die weitere Behandlung der Transkriptionsansätze nach dem Abstoppen der Reaktion bis zum Anlegen des Temperaturgradient en bei 4  ^oC. Eine Veränderung der Strukturverteilung wird so durch die bewirkte Stabilisierung der gebildeten Strukturen stark verzögert, denn die vorliegende Temperatur von 4  ^oC liegt weit unter den T_M-Werten von einzelnen Strukturelementen, sodaß die Umlagerungsgeschwindigkeiten verringert sind. Der dabei ebenfalls vorgenommene Wechsel von Hoch- zu Niedrigsalzbedingungen trägt ebenfalls zur Stabilisierung der Strukturen bei (Baumstark & Riesner, 1995; Riesner et al., 1992). Daher kann davon ausgegangen werden, daß die im Anschluß mittels TGGE analysierte Verteilung der Strukturen derjenigen direkt nach Transkriptionsstopp entspricht. Natürlich sollte zwischen dem Abstoppen der Reaktion und dem eigentlichen TGGE-Hauptlauf so wenig Zeit wie möglich vergehen.