Konstruktion der Transkriptionsvektoren

Entsprechend des in vitro-Nachweises der richtigen in vivo-Startstellen der Viroidreplikation durch die wirtseigene PolymeraseII auf der +-strängigen PSTVd-RNA (Fels, 1997) sollten in der vorliegenden Arbeit die folgenden Voraussetzungen von der Viroid-cDNA-Matrize für die in vitro-Transkriptionsexperimente erfüllt werden:

1. Die +-Strang-cDNA-Sequenz muß mit dem Nukleotid A₁₁₁ bzw. A₃₂₅ beginnen.
2. Da die in vitro-Transkription durch die T7-RNA-Polymerase erfolgen sollte, muß der Viroid-cDNA der $\Phi$10-Phagen-Promotor vorangestellt sein. Eine Verlängerung der zu synthetisierenden Transkripte durch zusätzliche ,,nicht``-Viroid-cDNA-Nukleotide am 5'-Ende sollte dabei möglichst ausgeschlossen werden.
3. Um ,,run-off``-Transkripte mit exakter Vollänge von 359nt zu erhalten, muß die zu klonierende Viroid-cDNA über eine entsprechende Restriktionsschnittstelle hinter dem Nukleotid A₁₁₂ bzw. G₃₂₆ verfügen.

Die Konstruktion der PCR-Primer, die den beschrieben Ansprüchen genügen und für die Amplifikation der cDNA eingesetzt wurden, ist in Abschnitt 4.1 erläutert worden. Die Linearisierung des Plasmids pSG111 durch ScaI ergibt ein glattes Ende hinter der inserierten cDNA, während bei der Restriktion des pSG325 mit SacII ein überhängendes 3'-Ende entsteht. Bei der Analyse der pSG325-Transkripte mußte dann allerdings festgestellt werden, daß unerwartete Überlängentranskripte entstanden, die die Auswertung der erhaltenen Strukturverteilungen erschwerten (vgl. Abb. 4.5 und 4.7). Entsprechende Phänomene, die auf die Beschaffenheit der Matrizenenden zurückzuführen sind, wurden kürzlich in der Literatur beschrieben (Rong et al., 1998): Die T7-RNA-Polymerase baut an überhängenden 3'-Enden die freien Nukleotide in das nascierende Transkript mit ein und wechselt dabei von dem Matrizenstrang auf den kodierenden (oberen) Strang, welcher weiter transkribiert wird. Um exakte Vollängentranskripte zu erhalten, sollte demnach bei der Konstruktion von cDNA-Matrizen für in vitro-Transkriptionsanalysen darauf geachtet werden, daß glatte oder überhängende 5'-Enden entstehen, mit denen, wie in der Literatur beschrieben und bei der Transkription von pSG111 auch beobachtet, keine Überlängentranskripte synthetisiert werden. Eine weitere Möglichkeit zur Vermeidung dieser ungewöhnlichen Transkripte könnte in der Behandlung der restringierten cDNA-Matrize mit einer 3'$\to$5'-Exonuklease bestehen. Allerdings ergibt sich dabei auch immer die Gefahr, daß nicht nur die überzähligen Nukleotide am 3'-Ende hydrolysiert werden, wodurch zu kurze cDNA-Matrizen entstehen könnten. Außerdem müßten die cDNA-Matrizen vor jeder in vitro-Transkription dieser Behandlung unterzogen werden.