Sekundärstrukturanalyse der pSG111-Transkripte

Abbildung: Theoretische Sekundärstrukturanalyse der pSG111-Transkripte durch das LinAll-Programm. A. Optische Schmelzkurve; B. Aus den sechs optimalsten Sekundärstrukturen gemittelter Retardationsplot; C. Retardationsplot der thermodynamisch günstigsten Struktur; D. Beispiele einiger in C. erhaltenen Sekundärstrukturen, die repräsentativ das Aufschmelzverhalten der RNA dokumentieren.

Die Abbildung 4.13 enthält die Ergebnisse für das pSG111-Transkript. In der Schmelzkurve sind drei Übergänge zu sehen, während der gemittelte Retardationsplot nur zwei deutlich zuerkennende Übergänge zeigt. Anhand der abgebildeten Sekundärstrukturen kann nachvollzogen werden, wie das Aufschmelzen des Transkriptes abläuft. Ausgehend von der Stäbchenstruktur (1) beginnt die Denaturierung in der rechten Hälfte, wodurch der erste Übergang zustande kommt. Dabei lagert sich die linke Stäbchenhälfte in den stabilen HPX um, der zum ersten Mal als Motiv in der dargestellten Struktur (7) zu finden ist. Das Auflösen sämtlicher Basenpaarungen in der rechten Hälfte bewirkt dann den zweiten Übergang (von (8) nach (9)). Der dritte, in der optischen Denaturierungskurve deutlich zu erkennende Übergang ist auf die Umlagerung der linken Hälfte in den HPII zurückzuführen, während der HPX nach wie vor erhalten bleibt. Mit dieser Umlagerung geht allerdings keine starke Mobilitätsänderung einher, was der dritte, flache Übergang im gemittelten Retardationsplot zeigt. In der experimentell ermittelten Gelkurve der Stäbchenkonformation (vgl. Abb. 4.6) treten ebenfalls zwei Übergänge auf. Überträgt man die aus den Temperaturgradient engelen ermittelten T_m-Werte auf die Salzbedingungen der theoretischen Berechnungen mit 1M Na⁺-Ionenkonzentration nach Langowski et al. (1978), die bei einer Verzehnfachung der Natriumkonzentration eine Erhöhung der Denaturierungstemperatur einer PSTVd-RNA von 13,2  ^oC vorschlagen, so ergibt sich:

	experimentell	theoretisch
Tm1	65  oC	68  oC
Tm2	73  oC	83  oC

Dabei stehen T_m1 für die Denaturierungstemperatur am ersten und T_m2 für die Temperatur am zweiten Übergang. Da die T_m-Werte auch von dem GC-Gehalt der RNA sowie den Sekundärstrukturmotiven und tertiären Wechselwirkungen abhängt (Steger et al., 1980), handelt es sich hier nur um eine grobe Abschätzung. Unter Berücksichtigung dieser Tatsachen unterstützen die theoretischen Berechnungen den experimentell gefundenen Bandenverlauf der thermodynamisch günstigsten Struktur, die auf jedem Temperaturgradient engel nachzuweisen war.

Da in den Hybridisierungsexperimenten zusätzliche Banden aufgetreten sind, wurden die oben durchgeführten Rechnungen auch in Kombination mit dem Oligonukleotid 27AB durchgeführt, um eine Vorstellung von den Wechselwirkungen zwischen Transkript und Oligonukleotid zu bekommen. Es handelt sich dabei allerdings nicht um eine exakte bimolekulare Rechnung. Die Komplexierung des HPII durch 27AB ist hier nicht zu erwarten, da zum einen keine entsprechenden Parameter für den im Komplex entstehenden internen Loop zur Verfügung stehen und es sich strenggenommen bei der Komplexwechselwirkung um eine Tertiärstruktur handelt, die von LinAll nicht berechnet werden kann. Die Ergebnisse sind in Abbildung 4.14 dargestellt.

Abbildung: Theoretische Sekundärstrukturanalyse der pSG111-Transkripte in Kombination mit dem Oligonukleotid 27AB durch das LinAll-Programm. A. Optische Schmelzkurve; B. Aus den sechs optimalsten Sekundärstrukturen gemittelter Retardationsplot; C. Retardationsplot der thermodynamisch günstigsten Struktur; D. Beispiele einiger in C. erhaltenen Sekundärstrukturen, die repräsentativ das Aufschmelzverhalten der RNA dokumentieren.

Es zeigt sich, daß das Oligonukleotid 27AB von der ersten bis zur letzten dargestellten Struktur abgesehen von vier Nukleotiden am 5'-Ende eine vollständig durchgepaarten Doppelstrang mit den Transkriptnukleotiden 220 bis 242 bilden kann. Das hier berechnete Aufschmelzverhalten unterscheidet sich nur wenig von dem in Abbildung 4.13 dargestellten. Die Denaturierung beginnt ebenfalls in der rechten Hälfte des Stäbchens, allerdings bildet sich auch schon in der ersten Struktur bei 40  ^oC der extrem stabile HPX aus, was auf die Struktursonde zurückzuführen ist. Zudem unterbindet 27AB die Ausbildung des HPII (Struktur (13)), wodurch der dritte Übergang in der optischen Schmelzkurve wesentlich flacher ausfällt. Mit diesen Ergebnissen lassen sich die zusätzlichen Banden ,,X`` und ,,Y`` auf den Temperaturgradient engel in Abbildung 4.9 erklären. Bei ausgebildetem HPII erfolgt die Hybridisierung der Struktursonde an die Loopnukleotide. In diesem Fall läßt sich der HPII wie erwartet nachweisen, was durch das Signal der Bande ,,Q`` (vgl. Abb. 4.9 und 4.10) bestätigt wird. Vergleicht man nun die Intensitäten der Banden ,,X`` und ,,Y`` mit der der Bande ,,Q``, so fällt auf, daß das Signal von ,,Q`` in dem Maße schwächer wird, wie sich die Signale von ,,X`` und ,,Y`` intensivieren. Dieser Sachverhalt deutet auf eine durch das Oligonukleotid bewirkte Umfaltung des HPII-Motivs in Abhängigkeit von der Temperatur hin. Mit der Bande ,,X`` lassen sich Strukturen detektieren, die weniger stark verzögert werden und bei etwa 28  ^oC einen reversiblen Übergang in die Strukturen der Bande ,,Y`` zeigen. Bei ,,X`` könnte es sich damit um ein Stäbchen mit gebundenem Oligonukleotid handeln, während ,,Y`` durch das Einfalten des Oligonukleotids in den HPII-Helixstamm entstanden ist.