Prinzip des Nachweises

Durch spezifische Struktursonden, die gegen einzelsträngige Sequenzbereiche hybridisiert werden, lassen sich Strukturelemente in Sekundärstrukturen nachweisen (Schröder, 1998; Uhlenbeck et al., 1970; François et al., 1994; Weller & Hill, 1992; Pinard et al., 1995).

Eine schematische Darstellung der Komplexierung der HPII-Struktur zeigt Abbildung 4.8. Das Oligonukleotid 27AB (vgl. Tabelle 2.1) wurde so konstruiert, daß es über den Helixstamm in den Loop hybridisieren kann. Dadurch müssen die zum Oligonukleotid komplementären Sequenzbereiche (in Abbildung 4.8 mit Region A bzw. B beschriftet) in räumlicher Nähe zueinander positioniert sein. Das ist genau dann und nur dann der Fall, wenn die Helix des HPII basengepaart vorliegt. Folglich sollten sich immer Hybridisierungsbedingungen finden lassen, die zu einem selektiven Nachweis von HPII-enthaltenden Strukturen geeignet sind und eine Bindung an Nicht-HPII-Strukturen verhindern.

Abbildung 4.8: Schematische Darstellung der HP II-Komplexierung durch das Oligonukleotid 27AB. (nach Schröder, 1998)

Basenpaarungen der 82 Loopnukleotide untereinander werden nur bei formierter Helix ausgebildet und entstehen dann unabhängig vom Restmolekül. Allerdings kann unter Umständen eine Komplexierung des HPII-Strukturmotivs nur unter Auflösung der basengepaarten Loopnukleotide erfolgen. Das Oligonukleotid muß also in der Lage sein diese Strukturen aufzulösen. Die freie Energie des entstehenden Komplexes darf auf der anderen Seite nicht so günstig sein, daß auch zuvor unzugängliche Strukturbereiche z.B. in der Stäbchenkonformation zugunsten der Hybrids aufgelöst werden. Um Strukturumlagerungen zu vermeiden, muß die Zugabe der Oligonukleotide im Unterschuß erfolgen, damit die vorliegenden Gleichgewichte zwischen den Strukturen bzw. die vorliegenden Konzentrationsverhältnisse nicht verschoben werden.

Um den Nachweis des HPII zu führen, wurde die Methode der Oligonukleotid-Kartierung mit der TGGE kombiniert. Die zu analysierenden Ansätze wurden nach der Transkription (in Abwesenheit von $\alpha^{32}_{}$P-UTP) mit radioaktiv markiertem Oligonukleotid inkubiert (nach Schröder (1998); siehe Abschnitt 3.6). Dazu wurden in den Ansätzen Hochsalzbedingungen (500mM NaCl) geschaffen, um die Hybridisierung zu erleichtern, das markierte Oligonukleotid im Unterschuß (Endkonzentration: 4,5nM) dazugegeben und der Ansatz für 20min bei RT inkubiert. Zur Verdrängung unspezifischer Wechselwirkungen wurde der Ansatz dann auf 320nM an unmarkiertem Oligonukleotid eingestellt und erneut für 20min bei RT inkubiert. Um die Ansätze auf die nachfolgende Analyse der Strukturverteilung mittels TGGE vorzubereiten, wurden die Proben für 1h bei RT gegen 0,2x TBE dialysiert und damit die den während des Gellaufs entsprechenden und für die Stabilität der Strukturen erforderlichen Niedrigsalzbedingungen hergestellt (vgl. Abschnitt ``Verwendete Ionenstärke`` auf S.). Wenn möglich wurde das Gel zusätzlich silbergefärbt, um entsprechende Banden der Autoradiographie zuordnen zu können. Das gilt für den untersuchten Inkubationszeitraum von 45min. In den 30s lang inkubierten Transkriptionsansätzen liegt die Konzentration der synthetisierten RNA weit unter der Nachweisgrenze der Silberfärbung, sodaß hier eine solche Färbung keinen Sinn machte. Aufgrund der niedrigen Konzentration an Transkript war die auf den Gelen durch die Hybridisierung der Struktursonden enthaltene Aktivität so gering, daß auch die Sensitivität der Autoradiographie zur Detektion nicht mehr ausreichte. Deswegen erfolgte der Nachweis in diesen Fällen mit dem Bio-Imaging-System (vgl. Abschnitt 3.5.5).