Untersuchung der mit pSG325 hergestellten Transkripte

Abbildung: TGGE-Analyse der --Strang-Transkripte mit dem 5'-Nukleotid U₃₂₅ in Abhängigkeit von der Transkriptionsdauer. Die Inkubationszeiten sind jeweils rechts neben den TGGEs angegeben. Als Längenstandard wurde mit HinfI restringiertes pBR322 verwendet. Die Autoradiographien wurden nach den folgenden Expositionszeiten (v.o.n.u.) erhalten: 5h, 21h, 4d. Die Strukturverteilung ist im Text erklärt.

Abbildung 4.7 zeigt die erhaltenen Strukturverteilungen durch die Transkription des Plasmids pSG325 in Abhängigkeit von der Transkriptionsdauer. Bei der Transkription dieses Plasmids mit der T7-RNA-Polymerase entstanden Überlängentranskripte (vgl. Abb. 4.5). Vor allem die 460nt langen Transkripte bilden aufgrund der teilweisen Sequenzgleichheit zu den Vollängentranskripten Strukturen, die die eigentlich nachzuweisende Strukturverteilung überlagern.

Die Entstehung von Überlängentranskripten wurde schon bei Rong et al. (1998) beschrieben. Diese ungewöhnlichen Transkripte entstehen bevorzugt an doppelsträngigen DNA-Matrizen mit überhängendem 3'-Ende und sind von der Sequenz unabhängig. Dabei inseriert die Polymerase die freien Nukleotide in das nascierende Transkript, wechselt dabei von dem Matrizenstrang auf den kodierenden (oberen) Strang und transkribiert diesen weiter. Dieser Mechanismus wird als ,,turn around transcription`` bezeichnet. Rong et al. (1998) konnten zeigen, daß im Extremfall bei der Transkription einer DNA-Matrize, die strangaufwärts vor dem Promotor ebenfalls ein überhängendes 3'-Ende besitzt, hochmolekulare Produkte durch ständiges Herumlesen der Polymerase entstehen können.

Die Linearisierung des Plasmids pSG325 mit SacII ergibt solche frei überhängenden 3'-Enden von 2nt Länge, was demnach ausreicht, neben den erwarteten ,,run-off``-Transkripten Überlängentranskripte zu amplifizieren und die zusätzlichen Banden in Abbildung 4.5 erklärt. Zwei Beispiele für solche Überlängentranskripte sind mit ,,I`` und ,,II`` beschriftet. Die Bande ,,I`` wird vermutlich von um etwa 460nt zu langen Transkripten verursacht, wodurch diese bei 50  ^oC dem höheren Molekulargewicht entsprechend langsamer als die Vollängentranskripte laufen (vgl. auch Abb. 4.5). Bei niedrigeren Temperaturen liegt dieses Transkript aufgrund der angehängten +-Strang-Nukleotide partiell als vollständig durchgepaartes doppelsträngiges Molekül vor. Damit stehen nur noch etwas mehr als 50 % der Sequenz zur Bildung von verzweigten Strukturelementen zur Verfügung, woraus eine erhöhte Mobilität der Moleküle im Vergleich zu stark verzweigten Vollängentranskripten von 359nt Länge resultiert. Dieser Effekt ist auf dem Gel nach 1h Transkription deutlich zu erkennen. Bei den Strukturen, die die Bande ,,I`` bilden, handelt es sich entsprechend um Moleküle mit noch höherem Doppelstranganteil, die entlang des Temperaturgradient en noch nicht einmal denaturieren. Die Abnahme der von den Überlängentranskripten hervorgerufenen Signale mit kürzer werdender Inkubationszeit ist mit der geringeren Anzahl an gebildeten Überlängentranskripten zu erklären.

Die Auswertung der entsprechenden TGGEs, wie sie in Abbildung 4.7 dargestellt sind, wird somit deutlich erschwert. Die Banden, welche zugeordnet werden konnten, sind mit ,,S`` und ,,R`` markiert und werden im Folgenden beschrieben.

,,S``:

Bei der mit ,,S`` bezeichneten Bande handelt es sich wiederum um die thermodynamisch stabilste Stäbchenkonformation. Diese Struktur wird nur wenig im Gel verzögert und zeigt bei ungefähr 24  ^oC den ersten und bei etwa 36  ^oC einen zweiten reversiblen Übergang. Eine Erklärung für diese Übergänge ist wiederum mit dem Aufschmelzen des linken und rechten Teils des Stäbchens bei verschiedenen Temperaturen zu erklären, was auch hier ebenfalls durch die Strukturvorhersage bestätigt wird (vgl. Abschnitt 4.4.2).

,,R``:

Eine stark verzögerte und deutlich aus der Strukturverteilung hervortretende Bande ist ,,R``. Diese Bande zeigt einen reversiblen Übergang bei etwa 36  ^oC und mündet dann in das Signal der vollständig denaturierten Einzelstränge.

Die hier erhaltenen Strukturverteilungen der Transkripte mit den in vivo-Startstellen gehen nicht konform mit den Ergebnissen von Repsilber (1995) und Rachen (1997), die deutlichere Unterschiede zwischen den Strukturverteilungen nach verschiedenen Transkriptionszeiten feststellen konnten. Metastabile Strukturen sind hier unabhängig von dem Inkubationszeitraum detektierbar und zudem dominiert in allen Fällen die von der Stäbchenstruktur gebildete Bande.