Untersuchung der mit pSG111 hergestellten Transkripte

Abbildung: TGGE-Analyse der --Strang-Transkripte mit dem 5'-Nukleotid U₁₁₁ in Abhängigkeit von der Transkriptionsdauer. Die Inkubationszeiten sind jeweils rechts neben den TGGEs angegeben. Als Längenstandard wurde mit HinfI restringiertes pBR322 verwendet. Die Autoradiographien wurden nach den folgenden Expositionszeiten (v.o.n.u.) erhalten: 2 h, 4d, 6d. Die Strukturverteilung ist im Text erklärt.

Abbildung 4.6 zeigt die Strukturverteilungen, die in Abhängigkeit von der Transkriptionsdauer bei 25  ^oC erhalten wurden. Auf den Autoradiographien sind nach den verschiedenen Inkubationszeiträumen (1h, 2min, 30s) keine gravierenden Unterschiede in der Strukturverteilung zu erkennen. Die in allen Fällen nachweisbaren Banden sind mit ,,O``, ,,P``, ,,Q`` und ,,S`` markiert.

,,S``:

Die Struktur, die in dieser Bande migriert, zeichnet sich durch hohe Gelmobilität aus und dominiert unter den Strukturen dieser Gele. Aufgrund der geringen Retardation und der hohen Konzentration kann dieser Bande die thermodynamisch stabilste Stäbchenstruktur zugeordnet werden. Diese Struktur weist in ihrem Denaturierungsprofil bei ungefähr 30  ^oC und dann wieder bei ungefähr 40  ^oC zwei charakteristische, reversible Übergänge auf, bis sie dann oberhalb von 40  ^oC als vollständig denaturierter Einzelstrang migriert. Dieses Retardationsverhalten der Stäbchenstruktur wurde schon von Hecker (1989) beschrieben und ist mit dem Aufschmelzen der rechten und linken Hälfte des Stäbchens bei unterschiedlichen Temperaturen zu erklären. Die bei Hecker (1989) durch Transkription des Plasmids pRH714 untersuchten monomeren --Strang-RNAs unterscheiden sich von den hier analysierten pSG111-Transkripten bezüglich der Startstelle deutlich. Die pRH714-Transkripte beginnen mit dem Nukleotid C₂₈₁, die pSG111-Transkripte mit dem Nukleotid U₁₁₁. Relativ gesehen liegen beide Startstellen allerdings 14nt (IVTpSG111) bzw. 11nt (IVTpRH714) vor der zentralen konservierten Region und haben von daher eine gewisse Ähnlichkeit. Das Übergangsprofil wird auch von der theoretischen Sekundärstrukturvorhersage bestätigt (vgl. Abschnitt 4.4.1).

,,O``:

Bei der diese Bande verursachenden Struktur scheint es sich um eine metastabile Konformation zu handeln, deren Konzentration mit steigender Inkubationszeit nicht oder nur geringfügig abnimmt. Sie wird recht stark verzögert und zeigt in allen Fällen einen irreversiblen Übergang in das Hochtemperatursignal bei ungefähr 40  ^oC. Es kann nicht eindeutig aufgelöst werden, ob sich diese Bande bei 30  ^oC noch in zwei weitere Banden auftrennt.

,,P/Q``:

Diese beiden Banden liegen unterhalb von 25  ^oC auf gleicher Höhe und spalten sich erst dann in getrennte Banden auf. Während sich ,,P`` bei einer Temperatur oberhalb des ersten Hauptübergangs des Stäbchens mit ,,S`` vereinigt, wird ,,Q`` noch stärker verzögert und geht bei 40  <sup>o</sup>C irreversibel in das Signal der denaturierten Einzelstränge über. ,,P`` liegt vermutlich eine Gleichgewichtsstruktur zugrunde, deren Anteil an den Gesamtstrukturen mit der Verringerung der Transkriptionsdauer abnimmt. Im Gegensatz dazu tritt die Bande ,,Q`` mit abnehmender Inkubationszeit etwas stärker in den Vordergrund.

Die unterhalb der länglichen Auftragstaschen nach 2min und 30s zu erkennende Aktivität ist auf Polymerase-RNA-Transkriptionskomplexe zurückzuführen, die nicht voneinander dissoziiert sind. Die mit steigender Temperatur einhergehende Viskositätsabnahme im Gel bewirkt die Verbreiterung dieses Signals durch das weitere Einlaufen der Komplexe bei höheren Temperaturen.