Konstruktion der Plasmide pSG111 und pSG325

Als Vorlage für die Amplifikation der cDNA-Fragmente wurde das Plasmid pST-B14 (Owens et al., 1986) verwendet. Dieser Vektor enthält die --Strang-Sequenz des PSTVd-Stamms ,,intermediateDi`` als Dimer (2x (88-359/1-87)) und konnte deswegen direkt für die Amplifikation der cDNA-Fragmente mit den für die Herstellung der cRNA-Transkripte relevanten 5'-Nukleotiden T₁₁₁ bzw. T₃₂₅ verwendet werden. Mit der Amplifikation der Viroidsequenzen mittels PCR sollten gleichzeitig sowohl der $\Phi$10-Phagen-Promotor für die T7-RNA-Polymerase als auch Restriktionsschnittstellen für die Linearisierung der zu konstruierenden Transkriptionsvektoren exakt hinter der inserierten Viroidsequenz und für die gerichtete Klonierung in den Vektor pRH701 entstehen. Diese Anforderungen konnten mit entsprechend konstruierten PCR-Primern realisiert werden (vgl. Abb. 4.1).

Abbildung 4.1: Schematische Darstellung der zur Amplifikation der Viroid-cDNA verwendeten PCR-Primerpaare. Gezeigt sind die Restriktionsschnittstellen für die Ligation mit dem Vektor pRH701 (BglII und EcoRI) sowie die Linearisierungsschnittstellen jeweils hinter der cDNA-Sequenz (ScaI bzw. SacII) und der Promotor für die T7-RNA-Polymerase . Die an den 3'-Enden angegebenen Nukleotidpositionen beziehen sich auf die Numerierung von PSTVd nach Gross et al. (1978). A. Primerpaar 111/112 zur Herstellung des cDNA-Fragments T7SG111. B. Primerpaar 325/326 zur Herstellung des cDNA-Fragments T7SG325.

Anfänglich wurde versucht die cDNA-Fragmente über beidseitig glatte Enden ungerichtet in den noch den $\Phi$10-Phagen-Promotor enthaltenden Vektor pRH701 einzuklonieren. Die Konstruktion der Transkriptionsvektoren konnte jedoch nach diesem Prinzip nicht realisiert werden. Daher konzentriert sich die weitere Betrachtung auf die schon oben angedeutete gerichtete Klonierung.

Ausschlaggebend bei der Wahl der Primer war, daß jeweils die 3'-Enden stabil an die Template-DNA hybridisieren müssen, um eine optimale Synthese durch die Taq-Polymerase zu gewährleisten. Die T_M-Werte der Primer eines Paares sollten nur um wenige Grad Celsius voneinander abweichen, damit eine Hybridisierungstemperatur optimal für beide Primer ist. Zudem sollte eine Dimerenbildung der Primer untereinander nach Möglichkeit verhindert werden, um eine effektiv hohe Konzentration der Monomere zu gewährleisten. Alle diese Parameter konnten mit den entsprechenden Programmen (siehe 3.10) überprüft und damit eine Optimierung der Primer durchgeführt werden. Die mit dem Poland-Programm berechneten T_M-Werte sind in Tabelle 2.1 aufgelistet. Die experimentell verwendeten Hybridisierungstemperaturen (vgl. Tabelle 3.1) sind allerdings um etwa 5  ^oC geringer als die berechneten, da nur dann die Amplifikation mit optimaler Sensitivität und Ausbeute durchgeführt werden konnte.

Die so amplifizierten cDNA-Fragmente T7SG111 und T7SG325 wurden dann für die Ligation mit dem Vektor pRH701 durch Restriktionsverdau mit BglII und EcoRI vorbereitet und geleluiert (siehe 3.3.2 und 3.7.4). Nach der Ligation mit dem ebenfalls mit BglII und EcoRI gedauten und dephosphorylierten Vektor pRH701, der somit den $\Phi$10-Phagen-Promotor nicht mehr enthielt, wurde der gesamte Ansatz zur Transformation von E.coli eingesetzt. Dabei wurden Transformationsraten in der Größenordnung von 5 x10⁴ Transformanden pro  $\mu$ g DNA erzielt. Im Vergleich dazu ergaben sich bei den Testtransformationen mit dem ,,supercoiled`` Plasmid pBR322 Raten um 1 x10⁷ Transformanden pro  $\mu$ g DNA. Aus einzelnen Kolonien wurden dann im kleinen Maßstab die Plasmide präpariert (siehe 3.7.1). Plasmide mit inserierter cDNA richtiger Länge wurde dann zur Sequenzierung ins BMFZ gegeben. Die Sequenzierergebnisse sind in Abbildung 4.2 dargestellt. Eine schematische Darstellung der Restriktionskarte der konstruierten Vektoren zeigt Abbildung 4.3.

Abbildung 4.2: Sequenzierdaten der Plasmide pSG111 und pSG325. Es wurden von jedem Plasmid jeweils beide Stränge mit den Primern T7-33 und Sma-47 (siehe Tabelle 2.1) sequenziert. Die Viroidsequenz ist fett gedruckt. Nicht automatisch als eindeutig detektierte Didesoxynukleotide (mit ,,N`` markiert) konnten anhand des Fluoreszenzscans überprüft und korrigiert werden. A. Viroid cDNA-Sequenz des Plasmids pSG111. B. Viroid cDNA-Sequenz des Plasmids pSG325.

Die Sequenzierung erfolgte nach der Methode von Sanger et al. (1977) mit fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotiden. Es wurden jeweils beide DNA-Stränge mit spezifischen Primern (siehe Tabelle 2.1) sequenziert, die mir freundlicherweise von Bernd Esters zur Verfügung gestellt wurden. Der Primer T7-33 hybridisiert 33 nt vor dem T7-Promotor, der Primer Sma-47 bindet 47 nt vor der SmaI-Schnittstelle auf dem Plasmid pRH701.

Im Anschluß an die Sequenzierung wurden die Plasmide aus den ausgesuchten Baterienkolonien im großen Maßstab präpariert (siehe 3.7.2). Daraus erhalten wurden 450 $\mu$ g pSG111 (0,9 $\mu$ g/$\mu$l) und 550 $\mu$ g pSG325 (0,9 $\mu$ g/$\mu$l). Diese Stammlösungen wurden für die weiteren Experimente verwendet.

Abbildung 4.3: Schematische Darstellung der Restriktionskarte der konstruierten Plasmide pSG111 und pSG325. Abgebildet sind nur die Restriktionsschnittstellen auf den Plasmiden, über die die Ligation der amplifizierten Viroid-cDNA mit dem Vektor pRH701 erfolgte (BglII und EcoRI), und die für die Linearisierung der Plasmide hinter der inserierten cDNA notwendigen Schnittstellen ScaI bzw. SacII.

Abbildung: 0,8 % Agarose Gel zur qualitativen Restriktionsanalyse der präparierten Plasmide pSG111 und pSG325. 1: pSG111, unrestringiert; 2: pSG111 mit ScaI restringiert; 3: pSG111 mit EcoRI restringiert; M: $\lambda$-DNA mit HindIII restringiert (Längenstandard); 4: pSG325, unrestringiert; 5: pSG325 mit SacII restringiert; 6: pSG325 mit EcoRI restringiert. Die Fragmentlängen des Markers sind rechts neben der Abbildung in bp angegeben.

Die in Abbildung 4.3 schematisch dargestellten Restriktionskarten werden durch die in Abbildung 4.4 gezeigte Restriktionsanalyse der präparierten Plasmide bestätigt. In den Spuren 1 und 4 sind jeweils die unrestringierten Plasmide zu sehen. Aufgrund der Superspiralisierung von zirkulär geschlossenen DNA-Molekülen sind zwei deutliche Banden zu erkennen. Die Plasmide liegen überwiegend in der superhelikalen Konformation vor. Daraus durch Einzelstrangbrüche entstandene, entspannte Zirkel werden stärker im Gel verzögert. Zudem ist in den Proben noch ein geringer Anteil an chromosomaler DNA enthalten, der direkt unterhalb der Auftragstaschen zu sehen ist. Die mit EcoRI linearisierten Plasmide (Spuren 3 und 6) laufen im Gel entsprechend ihrem Molekulargewicht. In den Spuren 2 und 5 wurden die Plasmide an den direkt hinter der inserierten Viroid-cDNA eingebauten Schnittstellen restringiert (ScaI bzw. SacII). Auf dem Plasmid pSG111 ist bei der Konstruktion eine weitere Schnittstelle für das Restriktionsenzym ScaI übersehen worden, was allerdings auf die Viroid-cDNA-Sequenz keinen Einfluß hat, da besagte Schnittstelle 523bp hinter dem Insert liegt. Das herausgeschnittene Fragment läuft in der Spur 2 am weitesten. Die durchgeführte Restriktion mit ScaI konnte nicht vollständig erfolgen, da es sich dabei um eine methylierungssensitive Schnittstelle handelt und der hier verwendete E.coli-Stamm DH5$\alpha$ in der Lage ist, die Adenine in der N-6 Position zu methylieren. Die singuläre Schnittstelle für SacII auf dem Plasmid pSG325 bewirkt nach der Restriktion denselben Effekt wie bei Linearisierung mit dem Enzym EcoRI (vgl. Spuren 5 und 6). Entsprechend dieser qualitativen Restriktionsanalyse ist es notwendig, vor der weiteren Verwendung der linearisierten Plasmide eine Gelelution durchzuführen (siehe 3.7.3), um unrestringiertes Plasmid abzutrennen und somit bei der anschließenden Transkription Überlängentranskripte zu vermeiden.

Abbildung 4.5 zeigt eine denaturierende 5 % PAGE zur Überprüfung der mit den konstruierten Transkriptionsvektoren präparativ hergestellten --Strang-Transkripte. Die Ansätze wurden im Anschluß an die Transkription mit DNase behandelt (siehe Abschnitt 3.3.4). Die Transkription von pSG111 ergibt für das erwartete Vollängentranskript ein deutliches Signal. Der Anteil an zu langen Transkripten ist vernachlässigbar gering. Im Gegensatz dazu erhält man bei der Transkription des pSG325 neben dem erwarteten ,,run-off``-Vollängentranskript eine große Anzahl an Überlängentranskripten.

Abbildung: Analyse der --Strang-Transkripte mittels denaturierender 5 % PAGE. Die Proben wurden jeweils in einer ${\frac{1}{\sqrt{10}}}$-Verdünnungreihe aufgetragen. Spuren 1-3: HinfI restringiertes pBR322 als Längenstandard. Die Fragmentlängen sind neben dem Gel in Bp angegeben. Spur 1 enthält ca. 125ng restringiertes pBR322. Spuren 4-8: Transkripte des pSG111. Spuren 9-13: Transkripte des pSG325. In den Spuren 4 und 9 wurde jeweils 1 $\mu$ l des präparativen Transkriptionsansatzes nach Behandlung mit DNase aufgetragen.

Der Grund für Entstehung dieser ungewöhnlichen Transkripte und die daraus resultierenden Probleme bei der Analyse der Strukturverteilung mit der TGGE werden in Abschnitt 4.2.2 ausführlich behandelt.