Gelelution von Nukleinsäuren aus Polyacrylamidgelen

Die Gelelution von durch PCR amplifizierten und restringierten DNA Fragmenten sowie von in vitro-Transkripten wurde etwas abgewandelt nach der Methode von Krupp (1988) durchgeführt. Die Nukleinsäuren wurden entweder mit nativer PAGE (DNA) oder mit denaturierender PAGE (RNA) elektrophoretisch aufgetrennt. Zur Detektion der Banden wurden die Gele für 5min in Ethidium-Bromid (2 $\mu$ g/ml) geschwenkt und anschließend kurz mit H₂O _{Milli - Q} gewaschen. Auf dem UV-Transluminator konnten so die entsprechenden Banden auf der Gelbond-Folie markiert werden. Die ausgeschnittenen Banden wurden auf Eppendorfgefäße verteilt, mit je 200 $\mu$ l Elutionspuffer-Puffer überschichtet und, um die Gelmatrix aufzubrechen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Nach dem Auftauen wurden die Proben über Nacht bei 4  ^oC geschüttelt. Der Überstand wurde dann in eine mit autoklavierter Glaswolle gefüllte, sterile 5ml Spritze (Becton Dickinson and Company; New Jersey, USA) gegeben. Die Eppendorfgefäße wurden nochmals mit je 100 $\mu$ l Elutionspuffer nachgespült, welcher ebenfalls in die Spritze gegeben wurde. Die Lösung wurde dann für 5min bei 5000rpm über die Glaswolle in ein 12ml Greiner-Röhrchen abzentrifugiert. Die Nukleinsäuren wurden dann mit Ethanol-Natriumacetat gefällt. Die Konzentration wurde mittels Spektralphotometer (siehe 3.9) bestimmt und mit nativer bzw. denaturierender PAGE (siehe 3.5.2 und 3.5.1) abgeschätzt.