Eigenschaften der Viroidstruktur

Mit Hilfe von Elekronenmikroskopie und einer Reihe von chemischen, physikalischen und enzymatischen Methoden konnte die native Sekundärstruktur des PSTVd aufgeklärt werden. Die zirkulär geschlossene, einzelsträngige Viroid-RNA nimmt, wie in Abbildung 1.1 schematisch dargestellt, aufgrund der Selbstkomplementarität der Sequenz eine unverzweigte, stäbchenförmige Konformation ein.

Abbildung: Schematische Darstellung der PSTVd-Sekundärstruktur. Oben ist die Sekundärstruktur und Sequenz des PSTVd-StammintermediateDi dargestellt. Unten ist die theoretische dreidimensionale Stäbchenstruktur gezeigt, deren Achsenverhältnis durch hydrodynamische Experimente zu 20:1 bestimmt wurde. (aus: Gross & Riesner, 1980)

In dieser Struktur liegen kurze Helices mit bis zu neun Basenpaaren vor, die durch ungepaarte Bereiche unterbrochen sind (Riesner et al., 1979; Sänger et al., 1976; Gross & Riesner, 1980; Wild et al., 1980). Durch diese Konformation erhält das Molekül eine nahezu optimale thermodynamische Stabilität und ist zudem aufgrund der Zirkularität vor dem Angriff von Exonukleasen geschützt.

Abbildung 1.2 zeigt Regionen in der PSTVd-Sekundärstruktur mit unterschiedlicher funktioneller Bedeutung. In der Mitte der Stäbchenkonformation befindet sich die zentrale konservierte Region (CCR), die im oberen Strang aus einem zentralen GC-Palindrom besteht. Bei diesem Bereich handelt es sich um den unter allen Viroiden der PSTVd-Klasse am stärksten konservierten Sequenzabschnitt. Diese Region ist für die Replikation von Bedeutung, da sich beim PSTVd die Prozessierungsstelle in der CCR zwischen den Nukleotiden G₉₅ und G₉₆ (Baumstark et al., 1997), sowie die eine der beiden Startstellen für die Transkription von +- in -strängige RNA an der Position A₁₁₁ (Fels, 1997) befinden. In der rechten Hälfte befindet sich ein Bereich, der zwischen den Viroiden weniger als 50 % Homologie aufweist und als Variable Region (Var) bezeichnet wird (Steger et al., 1984; Keese & Symons, 1985; Sänger & Haas, 1988). Das Stäbchen wird rechts und links von terminalen Loops flankiert, die mit T_R und T_L bezeichnet sind. Durch elektronenmikroskopische Untersuchungen konnte an diesen Stellen die Bindung von aufgereinigter Weizenkeim-PolymeraseII nachgewiesen werden (Goodman et al., 1984).

Abbildung: Schematische Darstellung der fünf funktionell bedeutenden Regionen in der PSTVd-Sekundärstruktur. T_L/T_R: linke und rechte terminale Domäne; VM: Virulenz-modulierende Region; CCR: Zentrale konservierte Region; Var: Variable Region. Nähere Erläuterungen sind im Text zu finden. (nach: Keese & Symons, 1985)

Durch Mutationen in der rechten terminalen Region (T_R) wird eine systemische Viroid-Infektion der Wirtspflanze verhindert, was eine Funktion dieses Bereichs im Rahmen des interzellulären Transports vermuten läßt (Hammond, 1994; Owens & Hammond, 1990). Die linke Molekülhälfte enthält die sog. Virulenz-modulierende Region (VM). Mutationen in diesem Bereich wirken sich stark auf die Pathogenität von PSTVd aus. Die Bandbreite reicht von ganz leichten Krankheitssymptomen nach Inokulation mit dem PSTVd-Stamm Mild bis hin zu stark verkrüppeltem Habitus, der durch Infektion mit dem PSTVd-Stamm RG1 hervorgerufen wird. Diese Pflanzen erreichen nur noch einen Bruchteil der ursprünglichen Größe. Als Referenz kann der PSTVd-Stamm intermediateDi angesehen werden, dessen RNA-Sequenz zuerst von Gross et al. (1978) publiziert wurde und als Vorlage für die hier durchgeführten Untersuchungen diente. Schnölzer et al. (1985) postulierten für die VM-Region einen Zusammenhang zwischen thermodynamischer Stabilität und Pathogenität, was sich allerdings nicht bestätigen ließ (Owens et al., 1996). Mittlerweile gibt es eindeutigere Hinweise, daß die Pathogenität mit der räumlichen Struktur dieser Region zusammenhängt (Schmitz & Riesner, 1998). In diesem Zusammenhang wird die Bindung eines zellulären Proteins an die VM-Region als ausschlaggebendes Ereignis für die Pathogenität diskutiert.

Eine weitere Eigenschaft, die die Viroidmoleküle auszeichnet, zeigt sich bei der thermischen Denaturierung, die in einem hochkooperativen Übergang erfolgt (Riesner & Steger, 1990; Riesner et al., 1979; Steger et al., 1984; Henco et al., 1979).

Abbildung: Modell zur Denaturierung der PSTVd-Sekundärstruktur. I-III markiert die HPI-III bildenden Bereiche. PM1-3 markiert die Vorschmelzbereiche (premelting regions). Nähere Erläuterungen sind im Text zu finden. (aus: Riesner et al., 1987, verändert)

Aus den Untersuchungen konnte das in Abbildung 1.3 gezeigte Modell entwickelt werden. Die Denaturierung beginnt in der linken Hälfte des Stäbchens, da sie aufgrund des geringeren GC-Anteils einen niedrigeren Schmelzpunkt aufweist und setzt sich über die drei sog. Vorschmelzbereiche (premelting regions (PM); Steger et al. (1984)) fort. Bei der Denaturierung in der linken Hälfte entstandene einzelsträngige Bereiche können mit zum Teil gepaarten, zum Teil ungepaarten Abschnitten in der rechten Molekülhälfte wechselwirken, wodurch diese destabilisiert wird. Die Folge ist eine hochkooperative Umfaltung, bei der sich die Stäbchenkonformation zugunsten einer verzweigten Struktur auflöst. Die neu geformte, verzweigte Konformation enthält drei stabile Haarnadelstrukturen (bezeichnet als HPI, HPII und HPIII; vgl. Abb. 1.3), die sich bei weiterer Erhöhung der Temperatur in Abhängigkeit von ihrer thermodynamischen Stabilität auflösen bis das RNA-Molekül als offener Zirkel vorliegt. Mit Ausnahme des ASBVd bildet sich der HPI bei allen Viroiden. Den HPII findet man, abgesehen von kleinen Variationen in der Sequenz, bei allen Pospi-Viroiden, während der HPIII ausschließlich bei PSTVd vorkommt. Der hochkooperative Übergang konnte für alle untersuchten Viroide gezeigt werden. Allerdings erfolgt er in diesem Fall bei einer geringeren Temperatur, als es für doppelsträngige RNA zu erwarten wäre. Da bei theoretischen Berechnungen mit vergleichbaren Zufallssequenzen und einigen anderen natürlich vorkommenden zirkulären RNAs keine dieser Eigenschaften erhalten wurden (Steger et al., 1984), handelt es sich hier um charakteristische Merkmale der Viroide.