Plasmid Mini-Präparation

Um die erhaltenen Bakterienkolonien auf positive Klone hin zu untersuchen, wurden einzelne Kolonien von den LB_amp-Platten mit einem autoklavierten Zahnstocher gepickt und damit 20ml LB_amp-Medium angeimpft. Bei 37  ^oC wurden die Zellen bis zu einer Dichte von 0,4 A₆₀₀ auf einem Schüttler (ca. 200rpm) wachsen gelassen. Durch die Zugabe von Chloramphenicol auf eine Endkonzentration von 170  $\mu$ g/ml und weitere Inkubation bei 37  ^oC über Nacht auf dem Schüttler erfolgt die Amplifikation der Plasmide. Chloramphenicol bindet an die ribosomale 50S Untereinheit und inhibiert die Proteinsynthese, während die Replikation der Plasmide weiter laufen kann (Sambrook et al., 1989). Die eigentliche Plasmidpräparation erfolgte mit dem Plasmid Mini Kit(20) (Qiagen, Hilden). Da es sich bei den aufzureinigenden Plasmiden um ,,low-copy-number``-Plasmide handelte und aufgrund dessen die Anzucht der Bakterien in 20ml, sprich dem doppelten Volumen, erfolgte, wurden auch die Volumina der verwendeten Puffer P1-P3 (vgl. Qiagen Plasmid Mini Handbook) verdoppelt. Am Ende wurde das getrocknete Pellet in 5 $\mu$ l H₂O _autokl. resuspendiert und die Konzentration im Spektralphotometer (siehe 3.9) bestimmt sowie über ein 0,8 % Agarosegel abgeschätzt. Ein Aliquot jedes der präparierten Plasmide wurde dann mit BglII und EcoRI restringiert, um mit einer 5 % PAGE zu kontrollieren, ob die entsprechenden Plasmide ein Insert richtiger Länge tragen.