Hybridisierung von Struktursonden

Eine Möglichkeit, Einzelstrangbereiche in RNA-Sekundärstrukturen nachzuweisen, ist die Hybridisierung von kurzen, spezifischen RNA-Oligonukleotiden gegen diese Strukturen (Schröder, 1998; Le Cuyter & Crothers, 1994; Uhlenbeck et al., 1970; Weller & Hill, 1992; Pinard et al., 1995). Im Rahmen dieser Arbeit wurde dieses Verfahren zur Detektion des HPII mit der Struktursonde 27AB (siehe Tabelle 2.1), die mir freundlicher Weise von Dr. A. Schröder zur Verfügung gestellt wurde, eingesetzt. Im Anschluß an in vitro-Transkriptionen (siehe 3.3.4) wurden die Ansätze auf 500mM NaCl eingestellt, das [ $\gamma^{32}_{}$P]-markierte RNA-Oligonukleotid 27AB in einer Endkonzentration von 4,5nM zupipettiert ($\approx$10⁵-10⁶cpm pro Ansatz) und der Ansatz ad 50 $\mu$ l mit H₂O _autokl. aufgefüllt. Nach Inkubation für 20min bei RT wurden 2 $\mu$ l unmarkierte Sonde (148ng/$\mu$l) zugegeben. Der Ansatz wurde weitere 20min inkubiert und dann 60min gegen 0,2x TBE bei RT auf einem Schwimmfilter (Type VS 0,025 $\mu$ m; Millipore GmbH, Eschborn) dialysiert. Die Strukturverteilung wurde über TGGE (siehe 3.5.3) aufgetrennt und das radioaktiv markierte Oligonukleotid konnte autoradiographisch oder mit dem Bio-Imaging-System detektiert werden (siehe 3.5.5).