Zur Analyse von PCR- und Restriktionsansätzen, in vitro-Transkripten und zur Konzentrationsabschätzung wurde die denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) verwendet. Die Kombination von Harnstoff mit einer Temperatur von 55 oC bewirkt denaturierende Bedingungen, um mögliche Sekundärstrukturen der zu analysierenden Nukleinsäuren aufzulösen. Dadurch ist das Migrationsverhalten der Moleküle rein von der Nukleotidzahl abhängig. Eine von der Werkstatt der Universität Düsseldorf angefertigte Kammer für vertikale Gele (21cm breit und 20cm hoch) diente als Elektrophoreseapparatur.
| Gellösung: | 5 % | Acrylamid/Bisacrylamid (30:1) |
| 0,5x | TBE-Puffer | |
| 8M | Harnstoff | |
| ad 20ml mit H2O Milli - Q | ||
| 0,1 % | TEMED (Radikalfänger) | |
| 0,055 % | APS (Polymerisationsstarter) | |
| Elektrophoresepuffer: | 0,5x | TBE |
| Probenauftragspuffer: | 95 % | Formamid |
| 10mM | EDTA | |
| 0,02 % | Bromphenolblau und Xylencyanolblau FF |
Vor der Zugabe von TEMED und APS wurde die Gellösung ca. 3min entgast, um
eine gleichmäßige Polymerisation zu gewährleisten. Die Gellösung wurde
zwischen zwei Glasplatten gegossen, die durch Teflonspacer einen Abstand
von 0,5mm voneinander hatten. Zur besseren Handhabung wurde das Gel an
einer Gelbond-Folie (Biozym, Hessisch Oldendorf) polymerisiert. Die
Polymerisation erfolgte für mindestens 1
Stunden.
Durch leistungsgesteuerte Gelelektrophorese wurde die zur vollständigen Denaturierung
der Nukleinsäureproben notwendige Temperatur erreicht. Vor dem Auftrag der
Proben wurden die Gele bei einer vom Spannungsgerät (Pharmacia Biotech, EPS
3550; Uppsala, Schweden) konstant gehaltenen Leistung von 70W
vorelekrophoretisiert. Zur gleichmäßigen Wärmeleitung über das Gel und die
Glasplatten wurden zwei je 2mm dicke Aluminiumplatten vor die Glasplatten
gespannt. Aufgeklebte Temperaturstreifen mit reversibler
Flüssigkristallanzeige (RS Components GmbH, Mörfelden-Walldorf)
ermöglichten die Kontrolle der Temperatur. Nach ca. 15min war eine
Temperatur von 55
oC erreicht. Das Auftragsvolumen betrug stets 20 
l
und enthielt 50 % Auftragspuffer. Vor dem Auftrag der Proben wurden diese
für 5min bei 95
oC denaturiert und anschließend in einem
Ethanol/Eis-Gemisch abgeschreckt (snap cooled). Das Einlaufen der Proben
ins Gel erfolgte für 5min bei 70W. Anschließend wurden die Proben für 25
bis 40 min bei einer Leistung von 40W elektrophoretisch aufgetrennt. Zum Nachweis
der Nukleinsäuren wurden die Gele mit Silber gefärbt (siehe 3.5.4).