in vitro-Transkription

Zur Untersuchung der sequentiellen Faltung von RNA-Strukturen wurde der folgende in vitro-Transkriptionansatz gewählt (nach Davenloo et al. (1984), verändert nach Hecker (1989)):

1 $\mu$ g	linearisiertes Plasmid
20mM	NaH2PO4, pH 7,7
10mM	DTT
1mM	NTP
8mM	MgCl2
4mM	Spermidin
40u	RNAsin
576u	T7-RNA-Polymerase (#8)
	ad 40 $\mu$ l mit H2O Milli - Q

Die linearisierten Plasmide wurden vor einer in vitro-Transkription stets geleluiert (siehe 3.7.3). Radioaktive Transkriptionsansätze enthielten zusätzlich 0,83 $\mu$ M $\alpha^{32}_{}$P-UTP (10 $\mu$ Ci/$\mu$l, 3000Ci/mmol). Die T7-RNA-Polymerase wurde von Herrn Bernd Esters isoliert und mir freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Alle Ansätze wurden, wenn nicht anders beschrieben, in Abhängigkeit von der Transkriptionsdauer bei 25  ^oC inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EDTA gestoppt, um die T7-RNA-Polymerase durch Komplexierung der Mg^{2 +}-Ionen zu inhibieren. In der Regel wurde ein gesamter Transkriptionsansatz auf einer TGGE (siehe 3.5.3) analysiert. Die präparative Herstellung von T7-Transkripten wurde wie folgt durchgeführt:

3 $\mu$ g	linearisiertes Plasmid
20mM	NaH2PO4, pH 7,7
10mM	DTT
1mM	NTP
8mM	MgCl2
4mM	Spermidin
40u	RNAsin
576u	T7-RNA-Polymerase (#8)
	ad 50 $\mu$ l mit H2O Milli - Q

Dieser Ansatz wurde für 90min bei 37  ^oC inkubiert. Nach erneuter Zugabe von 576u T7-RNA-Polymerase folgte eine weitere Inkubation für 90min bei 37  ^oC. Durch die Zugabe von 1 $\mu$ l 0,5M MgCl₂-Lösung und 278u DNase und Inkubation für weitere 15min bei RT wurde die Template-DNA abgebaut. Dann wurde der Ansatz auf 20mM EDTA eingestellt, um sämtliche Mg^{2 +}-Ionen zu komplexieren. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Phenol-Chloroform-Extraktion unterzogen (siehe 3.1) und die RNA anschließend mit Ethanol gefällt (siehe 3.2.1). Die Konzentration der RNA wurde sowohl im Spektralphotometer gemessen (siehe 3.9) als auch mittels denaturierender Gelelektrophorese (siehe 3.5.1) abgeschätzt.