Restriktionsendonuklease-Reaktionen

Um zum einen die durch PCR amplifizierten DNA-Fragmente fT7SG111 und fT7SG325 für die Ligation mit dem Plasmid pRH701 vorzubereiten und zum anderen die Plasmide pSG111 und pSG325 vor der in vitro-Transkription zu linearisieren, um ,,run off``-Transkripte mit definierter Länge zu erhalten, wurden Restriktionsendonuklease-Reaktionen durchgeführt. Der jeweilige Restriktionsenzym-Verdau erfolgte nach Herstellerangaben im mitgelieferten Reaktionspuffer. Präparative Ansätze enthielten zudem 1mM Spermidin, um den Bedarf an Restriktionsenzym auf 1/10 zu verringern (Pingoud, 1985; Pingoud et al., 1984). Im Folgenden werden die verwendeten Restriktionsendonukleasen aufgelistet und ihre Verwendung kurz vorgestellt.

EcoRI/BglII	Vorbereitung für die Ligation der Fragmente fT7SGXXX mit pRH701
ScaI	Linearisierung des Plasmids pSG111
SacII	Linearisierung des Plasmids pSG325
HinfI	Restriktion des Plasmids pBR322 (Längenstandard für PAGE (siehe 3.5.1 und 3.5.2))
HindIII	Restriktion von $\lambda$-DNA (Längenstandard für Agarose-Gelelektrophorese (siehe 3.5.6))

Die Restriktionsansätze wurden in der Regel über Nacht bei 37  ^oC inkubiert. Die restringierten PCR-Produkte wurden mit denaturierender PAGE (siehe 3.5.1) überprüft, restringierte Plasmide und die $\lambda$-DNA wurden mit Agarose-Gelelektrophorese (siehe 3.5.6) analysiert.